G. Callen kennt nur den ersten Buchstaben seines Vornamen, als Soldat in einer Undercover-Einheit der „Navy CIS“ aber ist er hervorragend ausgebildet. Gemeinsam mit dem ehemaligen Navy Seal Sam Hanna, der fließend arabisch spricht, geht Callen auf geheime Einsätze. Immer wenn es um die nationale Sicherheit der Vereinigten Staaten geht, sind die beiden Profis zur Stelle. Unter der Leitung der resoluten Henrietta „Hetty“ Lange gibt Callen in jedem Undercover-Einsatz sein Bestes. Überzeugend ist er, da er sich hervorragend in die unterschiedlichsten Charaktere hinein versetzen kann. Nebenbei versucht Callen auch, mehr über seine Vergangenheit, von der er so gut wie nichts weiß, herauszufinden.

Vince Chase ist Schauspieler und steht kurz davor, ein großer Star zu werden. Er lebt zusammen mit seinen besten Freunden Eric und Turtle, die er noch aus seiner Kindheit in Queens kennt, in Hollywood und verbringt seine Zeit mit kurzweiliger Unterhaltung. Um diesen Lebensstil für sich und seine Freunde weiterhin finanzieren zu können, muss er aber gelegentlich wieder vor die Kamera treten - The Show must go on!

Der Naval Crime Investigative Service wird dann gerufen, wenn Verbrechen begangen werden, die gegen den Uniform Code of Military Justice verstoßen und innerhalb der Navy stattfinden. Das Hauptquartier befindet sich in Washington D.C. und steht unter der Leitung von Special Agent Leroy Jethro Gibbs. Er selbst ist ein Veteran aus dem Irak-Krieg und hat mit moderner Technik wenig zu tun. Aus diesem Grund ermittelt er gemeinsam mit einem Elite-Team, bestehend aus dem Ballistik-Experten Tony DiNozzo, dem Technikspezialisten Tim McGee, der Forensikspezialistin Abby Sciuto sowie dem Gerichtsmediziner Ducky Mallard.

Die Polizistin Brenda Leigh Johnson zieht von Atlanta nach Los Angeles, um beim LAPD (Los Angeles Police Department) als Deputy Chief eine Spezialeinheit der Mordabteilung zu leiten. Die neue Einheit beschäftigt sich mit besonders schwierigen Mordfällen und hat zunächst den Namen Priority Murder Squad. Als Brenda das frischgedruckte Briefpapier mit dem Buchstabenkürzel PMS (prämenstruelles Syndrom) entdeckt, erfolgt schnell eine Umbenennung in Priority Homicide Division, aus der später die Major Crimes Division wird.