Agent Carter beginnt mit der Absturzszene aus dem Film Captain America – The First Avenger. Die Haupthandlung spielt ein Jahr nach den Ereignissen aus Captain America. Der Krieg ist vorbei. Peggy Carter ist Teil einer Sicherheitsbehörde, dem SSR, und dort die einzige Frau. Die anderen Mitarbeiter und ihr Chef Flynn nehmen sie nicht für voll, so dass sie, seit ihrer Versetzung vor drei Monaten, keinerlei Außeneinsätze mehr machen darf. Als sie alleine im Büro ist und erfährt, wo Zodiac zu finden ist, macht sie sich auf eigene Faust auf den Weg. Sie besiegt mehrere Männer und erobert Zodiac zurück. Am nächsten Tag will Flynn sie für ihr Verhalten bestrafen, doch er erhält einen Anruf von Howard Stark. Stark informiert ihn darüber, dass Carter nach Washington kommen und mit ihm die Organisation S.H.I.E.L.D. leiten soll. Flynn informiert Carter widerwillig darüber, dass sie zukünftig S.H.I.E.L.D. leiten soll.

Die leicht debilen Freunde Lloyd Christmas und Harry Dune sind in die Jahre gekommen. Als Harry ein schweres Nierenproblem plagt und auf ein Spenderorgan angewiesen ist, müssen sich die Kumpels auf die Suche nach einem geeigneten Spender machen – währenddessen machen sie eine unerwartete Entdeckung: In einer Nachricht erfährt Harry, dass er vor Jahren Vater geworden ist. Über Umwege bringen sie in Erfahrung, dass Harry mittlerweile eine erwachsene Tochter hat, die seine letzte Rettung vor den Folgen seiner schweren Nieren-Erkrankung sein könnte – und so wird das Hunde-Mobil auf Vordermann gebracht und eine wahnwitziger Road Trip beginnt, auf dem Harry seine Tochter finden möchte, um sein Leben zu retten, und Lloyd, um Harrys attraktive Tochter für sich zu gewinnen…