Im Mittelpunkt der Serie steht das hochmoderne Chicago Hope Hospital, in dem talentierte, aber auch problembeladene Ärzte arbeiten. Einer von ihnen ist Dr. Jeffrey Geiger, ein genialer Chirurg mit emotionalen Problemen, die in der psychischen Verfassung seiner Frau begründet liegen. Dr. Geigers bester Freund ist der Neurochirurg Dr. Aaron Shutt, der unter seiner Scheidung und unter der schlechten Beziehung zu seinem Vater leidet. Zum Team gehört auch die talentierte Herzchirurgin Dr. Kate Austin, die mit ihrer feministischen Einstellung und ihrem Ehrgeiz oft aneckt und mit Dr. Geiger um den Posten des Chefchirurgen konkurriert.

Der Naval Crime Investigative Service wird dann gerufen, wenn Verbrechen begangen werden, die gegen den Uniform Code of Military Justice verstoßen und innerhalb der Navy stattfinden. Das Hauptquartier befindet sich in Washington D.C. und steht unter der Leitung von Special Agent Leroy Jethro Gibbs. Er selbst ist ein Veteran aus dem Irak-Krieg und hat mit moderner Technik wenig zu tun. Aus diesem Grund ermittelt er gemeinsam mit einem Elite-Team, bestehend aus dem Ballistik-Experten Tony DiNozzo, dem Technikspezialisten Tim McGee, der Forensikspezialistin Abby Sciuto sowie dem Gerichtsmediziner Ducky Mallard.

Die Handlung dreht sich rund um die Arbeit einer Außenstelle des Naval Criminal Investigative Service in Louisiana. Das Team setzt sich aus Dwayne Cassius Pride, Chrostpher LaSalle, Meredith Brody, Sebastian Lund und Dr. Loretta Wade zusammen. Gemeinsam untersuchen die Ermittler spannende Fälle – vom südlichen Ende des Mississippi River bis hin zur nördlichsten Region in Texas.

Trinity ist ein kleines, typisch amerikanisches Städtchen, wo es sich hinter weißen Gartenzäunen und gut gepflegten Vorgärten gut und ruhig leben lässt. Vorausgesetzt, allen ist klar wer der Boss ist. Und das ist ohne Zweifel Sheriff Lucas Buck (Gary Cole), ein Mann, der Dank seiner übersinnlichen Begabung, Überzeugungskraft und dunkler Seele alle Fäden in der Stadt in der Hand hält. Das einzige, was ihm fehlt ist ein Nachfolger, jemanden den er nach seinem Bild formen kann. Da kommt der 10jährige Caleb Temple (Lucas Black) ins Spiel, doch entgegen aller Erfahrungen stellt sich dieser Junge als große Herausforderung für den Sheriff dar. Zusätzlichen Widerstand erfährt Lucas zudem durch Calebs Schwester und seine Cousine. Mystisch und spannend wird American Gothic nicht nur durch die unglaubliche Tiefe der einzelnen Charaktere, sondern vor allem dadurch, dass keine der Personen grundsätzlich gut oder schlecht ist.